二抗用于多種免疫測定中，以檢測一抗的存在。這些抗體與酶、生物分子或熒光染料偶聯(lián)，以便檢測一抗。與一抗不同，二抗針對一抗的物種和同種型產(chǎn)生，并通過在多個位點與一抗結(jié)合來檢測一抗。

要成功選擇二抗，應(yīng)考慮以下因素：

確保良好匹配 – 宿主物種是產(chǎn)生二抗的動物，應(yīng)始終與一抗的宿主不同。例如，如果您使用在兔子中產(chǎn)生的一抗，您將需要在兔子以外的其他物種（如山羊、驢或小鼠）中產(chǎn)生的抗兔二抗（圖 1）。

圖 1：二抗機制。

完整的抗體還是片段？ – 實際上，真正的問題是“您的一抗是單克隆還是多克隆？這兩個問題的答案通常取決于應(yīng)用程序。單克隆一抗包含免疫球蛋白的單一同種型。因此，使用特異性識別該同種型的二抗至關(guān)重要。此外，單克隆抗體通常在小鼠、兔子和大鼠中產(chǎn)生。因此，如果一抗是小鼠 IgG1，您將需要抗小鼠 IgG 或特異性較低的 F（ab） 片段抗小鼠 IgG。抗體片段適合免疫組化和免疫熒光，因為它們體積較小且能夠穿透組織。然而，較小的尺寸可能會限制與片段偶聯(lián)的染料或酶的選擇，從而導(dǎo)致二抗的靈敏度可能不如全抗體選擇。

多克隆一抗包含免疫球蛋白 G 的幾種同種型的混合物。因此，為了最大限度地檢測靶標(biāo)，最好使用可識別所有同種型的二抗。多克隆抗體通常在兔、山羊、綿羊和驢中以全抗體形式（重鏈 + 輕鏈）飼養(yǎng)，因此必須用來自不同物種的 IgG 庫對二級宿主物種進行免疫，從而使純化的二抗能夠識別所有形式。例如，如果一抗多克隆抗體是山羊 IgG，則需要抗山羊 IgG （H+L）。然而，全抗體會導(dǎo)致高背景和低特異性，因為輕鏈由所有免疫球蛋白共享，這會增加交叉反應(yīng)性（圖 2）。

圖 2：免疫測定中全 IgG 二抗與片段化二抗的結(jié)合機制。

根據(jù)您的應(yīng)用選擇偶聯(lián)物 - 這取決于二抗如何檢測信號。例如，免疫組織化學(xué)、ELISA 和蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用使用基于生物素標(biāo)記的比色和化學(xué)發(fā)光檢測來放大信號并提高靈敏度，以及與辣根過氧化物酶 （HRP） 或堿性磷酸酶 （AP） 起作用的酶促反應(yīng)。然而，對于免疫標(biāo)記、熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)實驗，使用熒光染料（如 Alexa Fluor）檢測信號，這些染料直接與抗體偶聯(lián)以放大信號和靈敏度。

親和純化抗體與交叉吸附抗體 – 此步驟用于提高抗體的特異性，并且可以在親和純化和交叉吸附方面進行區(qū)分。大多數(shù)二抗通過親和層析進行純化，從而產(chǎn)生高親和力抗體。這種抗體通常用于 IHC，因為它們提供最小的非特異性結(jié)合，也可用于 western blot 以檢測低豐度蛋白質(zhì)。交叉吸附的二抗通常會經(jīng)過額外的純化步驟，以過濾掉與脫靶免疫球蛋白種類結(jié)合的成員。此步驟增加了它們的特異性并降低了非特異性背景。這些抗體專為免疫組織化學(xué)等特定應(yīng)用而設(shè)計。